如何构建一个基因的过表达载体?是要真核表达的

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引物设计需要注意的地方很多,在大多数情况下,我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的.
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率.引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡.设计引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物长度
一般引物长度为18~30碱基.总的说来,决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度.有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度.
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各有不同,因此有时计算出的数值可能会有少量差距.为了优化PCR反应,使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性.
引物长度的上限并不很重要,主要与反应效率有关.由于熵的原因,引物越长,它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小.
② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%,一对引物的GC含量和Tm值应该协调.若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴.
③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度,是DNA双链结合.一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率,但是理想情况下一对引物的退火
温度是一样的,可以在55℃～75℃间变化.
④ 避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增
的成功是有帮助的.
⑤ 与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候,一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合,造成结果中有多个条带出现.这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测,

基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 　　将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体， 　　首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同
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首先需要你了解你需要的真和表达载体的各方面是不是符合你的要求，一定要有MCS位点，然后对你要进行表达的基因测序并根据序列设计引物，因为要重组到载体上，所以你要在引物两端各加上你所要用的限制酶的识别序列，这样就可以重组上去了，如果只用一种酶切的话就要注意连接的方向了，如果是两种酶的话就没事了，对于过表达，你得根据你自己的研究对象来对基因就行修改，但重组的方法就不变。...