用CaCl2制备感受态细胞怎么总是失败

1、 取大肠杆菌原始菌株（无外源质粒）单菌落接种于5mlLB培养液中,37℃,摇荡过夜；
2、 取1ml过夜培养物接种于100mlLB培养液中,37℃振荡培养1-3小时,待细菌达到对数生长期（OD600为0.5-0.6）即可；
3、 将培养液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中,置冰上10分钟,使菌液冷却到0℃,JA-25.5转头（要预冷）5000rpm、4℃离心15min；
4、 弃上清,每只离心管加入10ml冰冷的0.1M无菌CaC12将菌体重悬,冰浴放置30分钟,JA-25.5转头5000rpm、4℃离心5min；
5、 每只离心管加入2ml冰冷保存液（1.7ml 0.1MCaC12和0.3ml无菌甘油）重悬沉淀,将两管混合,按每样200ul分装于无菌1.5ml离心管中；
6、 迅速放置于-80℃保存备用.

注意： 事先准备三个小瓶子,0.1M CaCl2 10ml/瓶 X 2、保存液 4ml X 1.
制备前一天准备好溶液并灭菌.超净台操作时不要用酒精灯或远离之.
楼主核对下~~任何疑问百度我
其实正如楼上所说 cacl2效果真的不咋样

如果你觉得感受态没有问题，那么就先排除质粒和平板的问题。
转化效率的评估
我们建议转化（如下所述）不同浓度中等大小的质粒（约5kb）来评估转化效率，第一次检验，转化10-9,10-10,10-11g质粒DNA比较有意义。制备的最好的能达到108或更多克隆每ug质粒DNA，而达到5×106每ug质粒DNA可能已经适合做大多数的克隆了。另外，建议把自制的感受态涂到AP+KN板以排除污染...

用试剂盒吧。我们对比过CaCl2和试剂盒，CaCl2是很杯具的。。。

怀疑Call2的纯度，有条件可换用优级纯试剂