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幼苗
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这种情况在ni柱纯化时经常出现,你基本的方法没错,问题的根本原因是蛋白与填料的亲和力不够强,没法很好的洗脱杂蛋白,给你如下建议:
1,如果可行,在你的重组蛋白两端各加一个His-tag,这意味着你需要3天-7天的时间重新调整载体,这样会大大增强其亲和力,再用咪唑梯度洗就可以在20mM左右洗杂蛋白,在50-100mM左右洗目的蛋白,能较好的分离杂蛋白与目的蛋白;
2,如果重新构建不可行,对于你的先行体系,建议如下:
适当延长诱导表达时间,以增加目的蛋白含量;
在用咪唑梯度洗之前,先过3-5倍柱体积的buffer,先洗掉一部分杂蛋白,填料要保证已处理充分,既没有上次剩余的蛋白也有足够ni;
不要用这么多的梯度,有一点你需要明白,根据你现在的结果来看,60mM的咪唑是足以洗脱你的目的蛋白,而你的杂蛋白主要在20mM以下就洗差不多了,所以,你用buffer洗后,直接用5-10mM咪唑(用20mM洗的更干净,但目的蛋白肯定损失多,先试10mM)洗3-5个柱体积,以去除杂蛋白,再直接用60mM洗脱目的蛋白(也有可能60mM洗不下,那就试100mM).
这样做的策略就是:较低咪唑洗杂蛋白,再一次性用相对较高咪唑洗目的蛋白.洗杂蛋白的咪唑浓度越高,时间越长,你的蛋白就越纯,但同时目的蛋白的损失也更大,这就需要你自己摸索合适的咪唑浓度和时间,以取得你需要的蛋白纯度和浓度.
1年前
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